梯度PCR儀常見問題的主要解決方案分享

　　梯度PCR儀常見問題的主要解決方案：

　　1.梯度PCR儀在產(chǎn)物序列中引入了錯誤

　　這是由于聚合酶忠實性低或者循環(huán)數(shù)太多，這時需要使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，同時降低循環(huán)數(shù)。此外，四種dNTP的濃度不同也會出現(xiàn)該問題，此時應(yīng)制備新的濃度相同的dNTP混合物。

　　2.PCR跑膠

　　該現(xiàn)象表現(xiàn)為目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象。出現(xiàn)這樣的問題，則需要進(jìn)行細(xì)致的分析，因為引起該問題的可能很多。可先檢查是否模板質(zhì)量問題，如有降解等，模板應(yīng)避免反復(fù)凍融。也有可能是抽提RNA時有污染，則需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特異性擴(kuò)增引發(fā)該問題，可提高退火溫度，少循環(huán)次數(shù)。電泳緩沖液時間太長，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時電壓太高、電泳液過久沒換，電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問題。如果不是由上述原因引起，則進(jìn)一步檢查加樣量是否過大，制膠過程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴(kuò)增的條件不合適。針對具體原因再采取相應(yīng)的措施。

　　3.對梯度PCR儀產(chǎn)物需要用凝膠純化的時間掌控

　　當(dāng)凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶時，則無需使用凝膠純化；

　　當(dāng)可見其他雜帶時，則可能是積累了大量引物的二聚體，在克隆前需要做凝膠純化。